Warszawski Uniwersytet Medyczny (WUM)

Projekty badawcze realizowane przez Zakład Medycyny Regeneracyjnej:

1. Procesy starzenia a multipotencjalność komórek macierzystych dorosłych tkanek

Populacja bardzo małych komórek macierzystych (KM) o cechach embrionalnych, zdefiniowana fenotypem Sca-1 + lin-CD45- została zidentyfikowana w dorosłych tkankach organizmu. Postawiliśmy hipotezę, że komórki te zostają zdeponowane w rozwijających się narządach/tkankach na wczesnych etapach rozwoju embrionalnego, przeżywają etapy embriogenezy, a następnie biorą udział w procesach regeneracji jako populacja KM różnicujących w kierunku ukierunkowanych tkankowo KM. Wykazaliśmy ponadto, że VSEL różnicują in vivo w kierunku komórek krwiotwórczych, pneumocyty typu II nabłonka płuc, komórki nerwowe oraz komórki mezenchymalne. Liczba komórek VSEL spada wraz z wiekiem osobnika. Ponadto wczesny rozwojowo charakter komórek VSEL wykazaliśmy, poprzez i) zdolność VSEL do różnicowania w kierunku komórek potomnych należących do trzech listków zarodkowych, ii) prymitywną euchromatynę jądra komórkowego, iii) brak metylacji promotora genu Oct4 oraz aktywny trankrypcyjnie wzór białek histonowych w tym promotorze, iv) obecność domen dwuwartościowych w sekwencjach promotorowych ważnych rozwojowo czynników transkrypcyjnych zawierających tzw. homeodomeny, oraz v) reaktywację chromosomu X w żeńskich komórkach VSEL. Bezpośrednie analizy molekularne VSEL wykazały, iż potencjał proliferacyjny oraz liczba w dorosłych tkankach są regulowane poprzez modyfikacje epigenetyczne wybranych genów podlegających naznaczeniu genomowemu (m.in. Igf2-H19, Rasgrf1 oraz Igf2R), zaangażowanych w sygnałowanie somatotropowe. Zanotowano również zmiany stanu epigenetycznego komórek VSEL w zależności od wieku osobnika.

We współpracy z zespołem Prof. Diane Krause z Yale School of Medicine (Yale University) realizujemy badania fundowane przez Narodowe Centrum Nauki oceniające wpływ procesów starzenia na charakter pluri/multipotencjalny komórek VSEL oraz ich profil epigenetyczny. We współpracy z zespołem Dr. Krause oceniamy w dwóch niezależnych modelach in vivo potencjał regeneracyjny komórek VSEL izolowanych z dorosłych tkanek – potencjał krwiotwórczy oraz zdolność do różnicowania w komórki nabłonka płuc.

Celem projektu jest określenie wpływu wieku osobnika na pluripotencjalność komórek VSEL izolowanych z dorosłych tkanek. Ocenie ilościowej poddawana jest całkowita liczba komórek w tkankach izolowanych z młodych i starych myszy, stan epigenetyczny promotorów genów Oct4 oraz Nanog determinujących charakter pluripotencjalny oraz wzór białek histonowych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny. Równolegle opracowujemy strategie mające na celu zahamowanie spadku liczby VSEL podczas procesów starzenia, poprzez obniżenie poziomu IGF-1 i sygnałowania somatotropowego w warunkach restrykcji kalorycznej, po podaniu rapamycyny oraz wysiłku fizycznego. Poddawana jest również analizie zależność wieku osobnika z potencjałem regeneracyjnym komórek VSEL z wykorzystaniem dwóch modeli in vivo – odnowy układu krwiotwórczego oraz różnicowania w kierunku komórek nabłonka płuc.

2. Ocena fizjologicznej zdolności proliferacji i samo odnawiania pneumocytów II rzędu oraz oskrzelowo-pęcherzykowych komórek macierzystych powstałych w odpowiedzi na uszkodzenie płuc.

Badania polegają na ocenie możliwości różnicowania się niehematopoetycznych komórek macierzystych pozyskanych z mysiego szpiku kostnego (Sca-1+ CD45- CXCR4+ SSEA1+) w komórki macierzyste płuc – pneumocyty II rzędu (AT2, ang. alveolar type II). Celem realizowanego projektu fundowanego przez Narodowe Centru Nauki jest ocena fizjologicznej zdolności do proliferacji i samo odnawiania pneumocytów II rzędu (AT2, ang. alveolar type 2 cell) oraz oskrzelowo-pęcherzykowych komórek macierzystych (BASC, ang. bronchioalveolar stem cell) powstałych w odpowiedzi na uszkodzenie płuc. Modelem zwierzęcym są podwójnie transgeniczne myszy SPC-KO/SPC-TK pozbawione ekspresji białka SPC (ang. surfactant protein C) (SPC-KO) oraz zawierające gen indukujący apoptozę związane z promotorem genu SPC (SPC-TK). Podjęta tematyka w sposób istotny dotyka problemu regeneracji płuc koniecznych w różnego rodzaju stanach patologicznych. Pneumocyty II rzędu, jak również oskrzelowo-pęcherzykowe komórki macierzyste płuc stanowią bardzo mało liczne populacje komórek płuc, które bezpośrednio odpowiedzialne są za regenerację tego narządu. Komórki AT2 oraz BASC są wrażliwe na uszkodzenia, co jest powodem powolnej i często niewystarczającej regeneracji płuc. W związku z tym pojawia się konieczność opracowania skutecznej metodyki ich izolacji z uszkodzonych płuc, namnażania i ich różnicowania pozaustrojowego, a następnie wszczepienia do uszkodzonego narządu. Wyniki tych badań staną się istotnym przyczynkiem do podjęcia znacznie szerszego projektu, który będzie kontynuacją podjętego tematu.

3. Opracowanie nowych strategii przyspieszających procesy wszczepiania się krwiotwórczych komórek macierzystych

Przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych (KKM/P) jest szeroko stosowaną i ratującą życie procedurą kliniczną w hematologii. Jedno z największych wyzwań w transplantologii KKM/P jest związane ze zjawiskiem opóźnienia wszczepiania się lub jego brakiem. Stanowi to szczególny problem w sytuacjach kiedy liczba komórek KKM/P w materiale przeszczepowym jest niska (przykładowo komórek pobranych od dawców słabo mobilizujących się lub w przeszczepieniach KKM/P izolowanych z krwi pępowinowej). W realizowanym projekcie OPUS chcemy poddać kompleksowej analizie proponowane przez nasz zespół oraz opracować nowe bardziej efektywne strategie ułatwiające/przyspieszające wszczepienie się KKM/P do nisz krwiotwórczych w szpiku kostnym. Badania są prowadzone z wykorzystaniem mysich krwiotwórczych komórek macierzystych, w drugim etapie poddamy weryfikacji najskuteczniejsze strategie, wykorzystując model myszy z obniżoną odpornością, oceniając u tych zwierząt stopień wszczepiania się KKM/P izolowanych z ludzkiej mobilizowanej krwi obwodowej, szpiku kostnego oraz krwi pępowinowej.

By opracować optymalne strategie ułatwiające wszczepianie się podanych w materiale przeszczepowym KKM/P oceniamy modyfikacje ex vivo zwiększające tworzenie się tzw. tratw (domen) lipidowych w błonie komórkowej KKM/P na przyspieszenie wszczepiania się KKM/P do nisz szpikowych. Uwzględniając dane potwierdzające ekspresję w obrębie błony komórkowej KKM/P enzymów degradujących czynniki chemotaktyczne, co może wpływać na odpowiedź chemotaktyczną  KKM/P na gradient czynników ułatwiających ich wszczepianie się w szpiku kostnym, prowadzimy również szereg modyfikacji ex vivo, które modulowują ekspresję białek powierzchniowych oraz wewnątrzkomórkowych determinujących odpowiedź KKM/P na szpikowe czynniki chemotaktyczne. Ponadto oceniamy skuteczność zahamowania działania enzymów mogących degradować czynniki chemotaktyczne na poprawę wszczepiania się KKM/P. Równolegle oceniamy skuteczność nowatorskich strategii mających za zadanie zwiększenie stężenie czynników chemotaktycznych w szpiku kostnym, poprzez analizę poziomu ekspresji czynników chemotaktycznych dla KKM/P w szpiku kostnym po terapii mieloablacyjnej, a następnie przy wykorzystaniu specyficznych inhibitorów drobnocząsteczkowych hamujących ekspresję enzymów degradujących w niszach szpikowych czynniki ułatwiające wszczepiania (poprzez zastosowanie m.in. inhibitory metaloproteinaz, inhibitory enzymów degradujących bioaktywne lipidy S1P i C1P oraz inhibitory ektonukleaz CD39 oraz CD73 degradujących gradient chemotaktyczny ATP).

Prace te realizujemy we współpracy z zespołem Prof. Wiesława Jędrzejczaka Kliniki Chorób Wewnętrznych Hematologii i Onkologii WUM.

4. Ocena wpływu działania kinazy sfingozyny typu 1 oraz 2 na farmakologiczną mobilizację krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych.

Sfingozyno-1 fosforan (S1P) to bioaktywny sfingolipid obecny w błonie komórkowej, którego wysokie stężenie odnotowuje się zarówno we krwi jak i w limfie. S1P jest produkowany w przestrzeni międzykomórkowej poprzez zależną od ATP fosforylację sfingozyny, w procesie katalizowanym przez kinazę sfingozyny (SphK). Sfingozyna jest formowana jako produkt uboczny metabolizmu sfingolipidów. Pod wpływem enzymu sfingomielinazy, sfingomielina jest degradowana do ceramidu w błonie komórkowej, który następnie jest konwertowany do sfingozyny przez ceramidazę, która po fosforylacji tworzy S1P. Ze względu na swoją chemiczną strukturę, S1P w porównaniu do czynnika pochodzenia stromalnego (SFD-1), jest odporny na destrukcyjne działanie enzymów proteolitycznych, których stężenie zwiększa się w mikrośrodowisku szpiku komórkowego w odpowiedzi na promieniowanie lub chemioterapię stosowanych przy kondycjonowaniu przy przeszczepach krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych (KKM/P).

Kinazy sfingozyny to główne enzymy regulujące produkcję S1P. Aktywność SphK i w konsekwencji produkcja S1P jest zależna od licznych bodźców komórkowych, procesów, które w konsekwencji decydują o losie komórki. Do tej pory scharakteryzowano dwie izoformy kinazy sfingozyny: SphK1 i SphK2. Pomimo wysokiego podobieństwa w sekwencji aminokwasowej tych dwóch izoform, pochodzą one z dwóch odrębnych genów, posiadają różne drogi powstawania, tkankowo specyficznej ekspresji oraz lokalizacji w obrębie komórki, a także różne właściwości kinetyczne. Podczas gdy SphK1 znajduje się w cytoplazmie komórek eukariotycznych i jest aktywowana po przedostaniu do błony komórkowej, SphK2 znajduje się przy organellach komórkowych takich jak jądro komórkowe lub retikulum endoplazmatyczne. Różnice między tymi dwoma izoenzymami sugerują, że biorą one udział w odmiennych procesach fizjologicznych.

S1P stymuluje wzrost i proliferację komórek, ponadto bierze udział w hamowaniu apoptozy, stymulowaniu komórkowej przeżywalności, proliferacji i różnicowania, jak również w zapaleniu, angiogenezie, homeostazie wapnia, odporności, regulowaniu odpowiedzi na stres, a także wzmacnianiu migracji komórek normalnych oraz nowotworowych. Wykazano, że wśród bioaktywnych lipidów, sfingozyno-1 fosforan, razem z ceramido-1 fosforanem odgrywają istotną rolę w retencji limfocytów oraz jak odkryto niedawno, również krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych. Co ciekawe, biorąc pod uwagę fizjologiczne stężenie występujące w płynach ustrojowych, S1P jest silniejszym chemoatraktantem niż SDF-1. Pomimo iż rola SDF-1 wraz z jego receptorem (CXCR4) w retencji KKM/P w szpiku komórkowym w warunkach fizjologicznych jest bezsporna, to dokonano obserwacji sugerujących na występowanie innych czynników pełniących rolę chemoatraktantów w tym procesie. Krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe z wątroby płodowej pozbawione receptora CXCR4 zasiedlają środowisko szpiku komórkowego na drodze niezależnej od SDF-1 oraz proces wszczepiania się KKM/P do mikrośrodowiska szpiku kostnego jest tylko nieznacznie zredukowany po inkubacji komórek i współwszczepieniu ich wraz z antagonistą receptora CXCR4 – AMD3100. Obserwacje te wskazują na udział czynników lub/oraz mechanizmów niezależnych od SDF-1 biorących udział w mobilizacji oraz zasiedlaniu przez KKM/P mikrośrodowiska szpiku kostnego. S1P bierze udział w retencji KKM/P, a jego obecność w krwi obwodowej wpływa na wyjście tych komórek z mikrośrodowiska szpiku komórkowego w procesie mobilizacji.

Potwierdzeniem tych obserwacji są wyniki naszej niedawnej pracy, w której pokazujemy wpływ sfingozyno-1 fosforanu na wszczepienie KKM/P do niszy szpikowej. Wykazaliśmy, że myszy z niedoborem kinazy sfingozyny typu 1 (SphK1-KO) charakteryzują się upośledzonym wszczepieniem i zasiedleniem niszy szpikowych przez KKM/P pochodzące z myszy typu dzikiego (B6). Badania przeprowadziliśmy również z użyciem komórek szpiku pozbawionych receptora CXCR4, gdzie zaobserwowano jeszcze dłuższą odnowę krwiotworzenia u myszy SphK1-KO. Doświadczenia te wskazują na ważną rolę S1P w tych procesach. Jednakże, nie można wykluczyć udziału innych chemotaktycznych czynników takich jak ceramido-1 fosforan (C1P) oraz zewnątrzkomórkowe nukleotydy (np. ATP i UTP), jak również inne cząsteczki lub mechanizmy.

Uwzględniając wszystkie te informacje, postawiliśmy hipotezę, że wpływ SphK1 i 2 na regulacje poziomu S1P we krwi obwodowej jest różny, a przez to odmiennie będą one wpływały na zjawisko mobilizacji KKM/P z niszy szpikowej. Dlatego tematem prac projektu fundowanego przez Narodowe Centrum Nauki jest porównanie farmakologicznej mobilizacji KKM/P u myszy z niedoborem SphK1 i SphK2. Uzyskane wyniki mogą rozszerzyć wiedze na temat retencji tych komórek w mikrośrodowisku szpiku komórkowego oraz stanowić bazę dla dalszych, bardziej szczegółowych eksperymentów.

5. Rola hormonów przysadkowych w patogenezie i progresji nowotworu płuc

Szereg doniesień literaturowych wskazuje na istotną rolę hormonów płciowych (SexH) szczególnie wydzielanych przez przysadkę mózgową w rozwoju oraz progresji nowotworów wywodzących się z tkanek gonad, układu moczowo-płciowego oraz gruczou piersiowego.  Opublikowane dane naszego zespołu wykazały udział przysadkowych hormonów płciowych w regulacji biologii komórek nowotworowych mięśni szkieletowych oraz tkanek układu krwiotwórczego oraz limfatycznego. Wykazaliśmy ponadto, iż FSH, LH oraz prolaktyna stymulują proliferacje komórek ustalonych linii nowotworowych układu krwiotwórczego oraz komórek CD33⁺ izolowanych od pacjentów ze zdiagnozowaną białaczka typu AML oraz CML. Uwzględniając, iż poziom FSH wzrasta wraz z wiekiem prawdopodobnie na skutek stopniowego upośledzenia funkcji gonad,  postulujemy iż wzrost poziomu hormonów przysadkowych może sprzyjać rozwojowi chorób nowotworowych w tym raka płuc w populacji osób starzejących się. Wstępne dane mojego zespołu wskazują, iż wybrane linie komórkowe nowotworu płuc charakteryzują się silną ekspresją receptorów dla FSH, LH oraz prolaktyny. Celem weryfikacji hipotezy o udziale przysadkowych hormonów płciowych w patogenezie nowotworu płuc realizacjujemy trzy powiązanych ze sobą cele projektu OPUS: określenia wpływu przysadkowych hormonów płciowych na potencjał metastatyczny komórek raka płuc; analizę molekularną ścieżek przekazu sygnału wewnątrzkomórkowego z udziałem oksygenazy hemowej oraz kinazy MAPKp38 od pobudzonych receptorów dla przysadkowych hormonów płciowych w procesach przerzutowania komórek nowotworowych; ocenę poziomu ekspresji przysadkowych hormonów płciowych oraz ich receptorów w rokowaniu klinicznym pacjentów z nowotworami płuc.

Prowadzone badania określą po raz pierwszy rolę SexH w regulacji biologii komórek nowotworowych w modelu raka płuc oraz mechanizmów molekularnych zaangażowanych w ten proces. Uzyskane dane pozwolą na zaproponowanie nowych strategii terapeutycznych opartych na modulacji przekazu sygnału wewnątrzkomórkowego od receptorów dla SexH. Odpowiedzą ponadto czy zastosowanie czynników modulujących aktywność HO-1 i/lub inhibitorów receptorów hormonów przysadkowych stwarza potencjalne możliwości ich zastosowania klinicznego w terapii nowotworu płuc.